前言

由于关节软骨结构特殊，其自我修复能力有限。无论损伤是创伤性还是疾病诱发的，软骨组织都会引发炎症变化，例如释放肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和趋化因子等炎症介质。此外，它们还会促进基质降解酶（如基质金属蛋白酶（MMPs）和解聚蛋白样金属蛋白酶（ADAMTS）家族）的增加。这些酶不仅破坏细胞外基质（ECM）的结构，还会产生降解产物，这些产物引发更强的炎症反应，并顺利获得胶原蛋白和蛋白聚糖成分的丢失促进ECM的逐渐降解。这影响了一系列细胞和基质的功能，并导致软骨下骨损伤，从而形成骨赘。

在再生医学中，传统的支架植入通常需要大的手术切口，并伴有疼痛和感染等并发症的风险。然而，微组织的微创植入可以避免这些问题，并能够灵活修复形状不规则的软骨缺损。微组织是能模拟靶器官或组织功能的微小组织团簇。单独使用细胞构建微组织常导致坏死核心形成。然而，天然软骨的ECM既能给予结构支撑，又是微载体的理想来源。

ECM脱细胞能够去除细胞成分和其他抗原性物质，这降低了炎症反应和免疫排斥的风险，同时保留了ECM的生物、机械和生化特性。因此，脱细胞ECM可以作为细胞接种的可靠三维（3D）载体。

近期，Materials Today Bio【IF：10.2】在线发表了一篇题为“High paracrine activity of hADSCs cartilage microtissues inhibits extracellular matrix degradation and promotes cartilage regeneration”的研究文章，该文章顺利获得3D FloTrix® MicroSPIN 6通道搅拌旋转式生物反应器构建的ADSCs微组织（ADSCs-MT）实现了优异的软骨再生效果，有望有助于软骨微组织的自体应用。

原文链接：http://doi.org/10.1016/j.mtbio.2024.101372

  研究背景

组织工程通常顺利获得再细胞化实现支架的再增殖，因此需要具有特定结构和功能的构建体。干细胞因其强大的增殖和分化能力而被广泛用于再细胞化。在此类干细胞中，胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）表现出最大的生长和分化潜力。然而，它们的使用涉及伦理问题，并且它们向特定细胞谱系的分化相当耗时。相比之下，间充质干细胞（MSCs）因其优异的免疫特性和软骨分化能力而被广泛应用于软骨组织工程。此外，与软骨细胞相比，MSCs可以顺利获得侵入性较小的程序自体获取。虽然同种异体MSCs理论上降低了免疫排斥的风险，但研究表明，它们的存活率显著低于自体MSCs，并且可以促进具有记忆表型的T细胞产生。

在本研究利用两种主要的同一个体MSCs来源——脂肪来源干细胞（ADSCs）和骨髓来源干细胞（BMSCs）——来构建微组织并进行系统比较。ADSCs和BMSCs都易于顺利获得符合伦理的方式获取，并且它们的应用前景已得到充分验证。BMSCs是组织工程中最早使用的MSCs，可以分化成多种组织。然而，ADSCs更容易从皮下脂肪中大量获取，在软骨修复中也显示出显著的再生优势，造成的损伤更小。值得注意的是，ADSCs和BMSCs的再生潜力可能因支架和治疗环境而异。尽管许多研究已探讨了这两种细胞的软骨形成能力，但在微组织构建背景下对它们进行系统评估和比较的研究相当有限。因此，比较ADSCs和BMSCs在微组织中的表现对于推进其临床应用至关重要。

▲图1 ：3D FloTrix® microSPIN 6通道微型生物反应器

本研究制备了微载体，并比较了两种同源细胞在微载体环境中的行为特征。微载体微环境凸显了ADSCs的优势，显著促进了该细胞的增殖与迁移。随后顺利获得3D FloTrix® MicroSPIN 6通道搅拌旋转式生物反应器构建了ADSCs微组织（ADSCs-MT）与BMSCs微组织（BMSCs-MT）。体内外实验证实ADSCs-MT的软骨再生能力显著优于BMSCs-MT。转录组学分析表明ADSCs-MT中ECM降解、成骨分化及纤维软骨标志物的表达水平显著降低。最终验证了微组织对炎症软骨细胞的保护作用。本研究构建的ADSCs-MT实现了优异的软骨再生效果，有望有助于软骨微组织的自体应用。

研究设计

▲图 2 ：整体研究设计图

示意图展示利用cECM微载体制备ADSCs-MT与BMSCs-MT的过程，以及顺利获得成软骨诱导的ADSCs-MT实现软骨再生的体内外验证实验。

  研究内容

在实验前期制备了软骨来源的脱细胞细胞外基质（cECM）及其微载体的基础上，顺利获得3D FloTrix® MicroSPIN 6通道搅拌旋转式生物反应器构建ADSCs-MT与BMSCs-MT并进行相关评估。

▲图 3 ：体外评估ADSCs-MT与BMSCs-MT

(A) 微组织制备流程示意图。

(B) 微组织制备关键时间点图像。

(C) 微组织扫描电镜（SEM）微观形貌观察。

(D) 两组微组织中SOX9、COL2及ACAN的mRNA表达水平。

(E) 两组微组织SOX9蛋白免疫荧光检测。

(F) SOX9蛋白表达定量分析。

(G) 两组微组织COL2与ACAN蛋白的Western blot分析。

(H) 微组织H&E染色与甲苯胺蓝染色结果。

(I) 三种趋化梯度下的Transwell细胞迁移实验。

进一步比较脂肪源性干细胞微组织(ADSCs-MT)与骨髓间充质干细胞微组织(BMSCs-MT)的基因表达及调控通路差异，对两种微组织分化后进行了mRNA-seq分析。

▲图 4 ：两组微组织中mRNA测序及差异表达基因(DEG)分析

(A)两组微组织表达基因的维恩图。

(B)两组微组织RNA测序数据的火山图。

(C)差异表达基因热图。

(D)差异表达基因的GO富集分析。

(E)差异表达基因的KEGG富集分析。

为深入探究ADSCs-MT细胞的发育与分化进程，在培养关键时间点（第0天、第7天和第14天）对ADSCs-MT进行了RNA测序。

▲图 5 ：在hADSCs-MT培养过程中的关键时间点进行mRNA测序和差异表达基因（DEG）分析

（A）ADSCs-MT在D0、D7和D14天表达基因的维恩图。

（B）差异表达基因热图。

（C、F、I、L）D7与D0比较的火山图、GO富集分析、KEGG分析和差异表达基因PCR验证。

（D、G、J、M）D14与D0比较的火山图、GO富集分析、KEGG分析和差异表达基因PCR验证。

（E、H、K、N）D14与D7比较的火山图、GO富集分析、KEGG分析和差异表达基因PCR验证。

ADSCs-MT展现出更强的旁分泌效应，并具有软骨保护特性。

▲图 6 ：ADSCs-MT发挥软骨保护作用

(A)用于微组织与人软骨细胞共培养的Transwell系统示意图。

(B)各组软骨细胞中基质形成相关基因(COL2和ACAN)与基质降解相关基因(MMP1、MMP13、ADAMTS4和ADAMTS5)的相对表达量。

(C)各组软骨细胞中COL2和ACAN的蛋白表达。

(D)COL2和ACAN蛋白表达的定量分析。

(E)MMP13的免疫荧光分析。

(F)基于免疫荧光检测的MMP13蛋白表达分析。

基于宏观评估、组织学染色和免疫荧光染色，考察了裸鼠皮下植入不同微组织8周后的组织再生情况。

▲图 7 ：裸鼠皮下植入8周后再生组织评估

(A)各组裸鼠皮下植入8周后再生组织大体观。

(B)苏木精-伊红染色。

(C)甲苯胺蓝染色。

(D)番红O染色。

(E)COL2免疫组化染色。

(F)COL1免疫组化染色。

(G)SOX9免疫荧光染色

  研究结论

本研究将同源ADSCs与BMSCs分别与细胞外基质（cECM）微载体结合，在三维动态培养环境中构建了ADSCs-MT和BMSCs-MT微组织。顺利获得体外与体内实验对两类微组织进行系统评估，结果表明ADSCs-MT具有优异的软骨分化能力和强大的旁分泌特性，能有效保护炎症环境中的软骨细胞，并在体内促进高质量软骨组织的再生。本研究为微组织构建及有效促进软骨再生给予了新的见解与证据。

研究应用材料及设备

① 六位平行：可同时进行6种工艺条件探索验证，极大缩短研发周期。

② 多模式搅拌：循环搅拌，匀速搅拌，间速搅拌。

③ 十种工艺编程：可预设十种工艺，实现一键操作，便捷高效。

④ 自定义多孔位联动：支持孔位关联功能，实现平行过程控制。

⑤ 高精度控制：转速最小稳态误差控制在±1 rpm以内，保证实验结果稳定性。

⑥ 抗磁场干扰技术：自主研发的抗磁场干扰技术，使每个孔位运行时互不干扰。

⑦ 复合散热设计：高导热材质，独立散热风道，维持细胞生长稳态环境。

⑧ 迷你机型：整体高度仅75 mm，占用体积0.05 m³，一台170 L培养箱可放置4台microSPIN反应器，可同时进行24组对照实验。

⑨ 人性化设计：扁平数据线设计，更易从夹缝中穿出；30度倾角视窗设计，便于站立观察。

作者简介

第一作者：刘伟，女，山东第一医科大学 ( 山东省医学科学院 )与解放军总医院联合培养硕士，主要从事软骨损伤和组织工程修复研究。

通讯作者：亓建洪教授，山东第一医科大学 ( 山东省医学科学院 ) 运动医学与康复学院 ，主任医师，博士生导师。

通讯作者：彭江教授，中国人民解放军总医院骨科医学部研究所所长，全军骨科战创伤重点实验室主任，主任医师，博士生导师。

通讯作者：汪爱媛教授，中国人民解放军总医院骨科医学部研究所，研究员。长期从事骨软骨组织工程技术基础及临床转化研究。

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